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中国医学论坛报:肿瘤标志物检测的影响因素及质量控制
 
  来源:中国医学论坛报  日期:[ 2013-10-15 ]
 

肿瘤标志物检测的影响因素及质量控制

范华杰  关明

复旦大学附属华山医院  检验科

 

    近年来,恶性肿瘤已成为目前我国城市居民中死亡率最高的疾病。WHO发表的癌症控制方案中指出:通过早期发现、早期诊断和早期治疗,有三分之一的癌症是可以治愈的。由此可见,早期诊断对于肿瘤的防治具有举足轻重的作用。肿瘤血清学标志物已成为继病理学、影像学诊断之后,最重要的诊断标准,为肿瘤的早期诊断、良恶性鉴别、病理分型提供更可靠的依据。

肿瘤标志物简介

    肿瘤标志物(tumor marker)是在恶性肿瘤的发生和增殖过程中,由肿瘤细胞合成分泌的、或由机体对肿瘤反应而异常产生或升高的物质,其在血液、尿液、浆膜腔积液或其他组织液中的含量发生改变。肿瘤标志物可以由肿瘤组织直接产生,亦可是由非肿瘤组织对肿瘤的反应所产生(铁蛋白、肿瘤坏死因子、白介素受体等),另外,某些核酸分子(miRNA、甲基化DNA)也可作为肿瘤标志物成分。肿瘤标志物被广泛用于肿瘤的检测和诊断,其水平的升高可预示着肿瘤的发生,然而也可由其他原因所致。

肿瘤标志物的类型

    目前已定义的肿瘤标志物主要有下列类型:胚胎抗原类(AFP、CEA等),糖类抗原类(CA125、CA153、CA199等),酶和同工酶类(NSE、ACP、LDH等),激素类(β-HCG、ACTH等),特殊蛋白类(铁蛋白、β2-MG、SCC、TPA等),癌基因蛋白类(ras基因蛋白,myc基因蛋白,p53抑癌基因蛋白等)、还有其他未归类的肿瘤标志物(唾液酸酰基转移酶、唾液酸和多胺等),此外某些已知感染后可致肿瘤的病毒(EBV、HSV、HPV、HTLV-1等)也可作为肿瘤标志物。

肿瘤标志物的特性

    1847年,英国内科医生Henry Bence Jones加热多发性骨髓瘤患者的酸化尿液,发现凝溶蛋白的那一刻,即标志着肿瘤标志物的检测走进了临床检验的领域之中。随着新的检测方法的建立和检测灵敏度的提高。肿瘤标志物的检测由蛋白质水平迈向了分子诊断水平。

    在提高检测灵敏度的同时,伴随着寻找和选择更为合适的肿瘤标志物,成为临床检验工作者不断努力的目标。理想状态中的肿瘤标准物,应具有优异的特异性(非肿瘤患者100%真阴性率)、高灵敏度(肿瘤患者100%阳性率)、较强的器官选择性(指向特定的组织器官)、良好的诊断评估性(准确反映病情程度)以及疗效观察性(能作为疗效监测)和预示性(反映病情预后)的优点。

    追求优质的检测质量,是现代临床检验工作的宗旨之一。从最早阴、阳性的简单判定,到后来进一步的半定量检测,直至现今的定量数值化,临床诊疗对肿瘤标志物的检测质量要求也日益增高。提高肿瘤标志物检测的质量,主要围绕着分析前、分析中和分析后三点来要求的。

分析前的因素

    分析前,是指临床医师提出检测申请直到样本在检测前的时间段,所受的影响因素主要包括患者因素、样本采集运送因素、实验室检测前准备因素。

①  患者因素

    如同其他临床项目的检测,患者准备是检验前的一项重要环节。多数肿瘤标志物都或多或少受生理、病理和药物因素的影响。例如妊娠妇女血清中AFP的生理性升高;经期女性及妇科炎症患者血清中CA125的增高;男性直肠指诊、前列腺按摩常会使血清PSA含量增高;长期吸烟人群的CEA水平要较非吸烟者为高;以及严重肝肾功能损害的患者,其体内肿瘤标志物的转化和降解较他人为慢,致使在血循环中淤积而增加。大麻类毒品可引起hCG的短暂升高,5α还原酶抑制剂药物(保列治、非那雄胺等)的服用可使PSA水平下降50%。采样前必须对患者或临床医师进行告知,以排除或尽量降低患者自身因素对检测结果的影响。

②  样本采集运送因素

    正确选择样本采集管。现代免疫学检测肿瘤标志物多采用血清、血浆或浆膜腔积液样本,最好采用没有添加剂的干试管来收集样本,肝素抗凝剂也可以应用在肿瘤标志物的检测中,但不要使用EDTA等其他抗凝样本。

    正确采集样本,防止样本被污染。采血时应注意不要长时间绑扎压脉带,静脉穿刺尽可能顺利,若使用针筒抽血,将血液注入试管时,应先将针头取下,整个过程应缓慢,避免产生气泡,否则易引起溶血。溶血对各类肿瘤标志物检测均有不同程度的影响,影响最大的是酶类肿瘤标志物,如NSE、LDH,红细胞破坏后其中的酶释放入血清中,可严重干扰检测结果。经皮肤静脉穿刺采血时,血样若受汗液污染,可致使SCC的假性升高。采血管密闭不严,受诸如唾液等外源物干扰可影响血清中细胞角蛋白CYFRA211的结果。标本运送过程中应注意保存温度,避免受热,热处理尤其对HCG和PSA影响较大。前者在温度升高时可分解为游离α和β亚基,而后者在热环境中,总PSA和游离PSA的稳定性明显不同。如未能及时送检可采取合适的保存温度,一般来说4℃适合多数标本的短期保存,-30℃可作长期保存,更长时间的保存应置于-70℃环境内,然而多数酶类肿瘤标志物受温度影响较大,如有此类检测项目建议立即送检。

③  实验室分析前准备因素

    实验室收到样本后应及时离心分离血清。因为时间的推移,某些酶类可能会失活,如ACP在采血1小时后,室温中活性可下降50%。离心时要选取合适的相对离心力,离心速度不宜过高,避免细胞组分遭受破坏,时间不宜过长,防止温度升高。

    实验室在正式开展项目前,应编制正确有效的样本采集手册,并充分做好同临床医师及患者的宣教和沟通,定期对患者准备情况以及整个样本采集运送和处理过程进行抽验评估,以确保分析前质量得到充分保障。

分析中的因素

    分析中的准确性由检测体系自身、有无内外部干扰,及是否有良好的质量管理体系所决定。

①检测体系因素

    方法间的差异。现代免疫学检测系统是肿瘤标志物检测的核心环节。随着科技的发展,临床免疫学检验技术的发展日新月异,检测方法层出不穷。目前用于肿瘤标志物检测的常见方法有:散射比浊法、酶联免疫法、化学发光法、电化学发光法、时间分辨免疫荧光法、放射免疫分析等。不同的检测体系技术上的差异直接造成了各方法间的的灵敏度、检测限等不同,直接造成了结果的差异,尤其对于浓度位于医学决定水平处的样本,甚至可以产生截然不同的定性结果。

    可靠溯源体系的缺乏。对于经典的蛋白质和酶类检测体系,目前已有成熟的溯源系统。而对于肿瘤标志物检测体系来说,由于其发展快速,不断有各种组分被发现并引入作为新的肿瘤标志物。而溯源体系的建立却变得相应滞后。目前为止相当多的肿瘤标志物检测系统既无参考测量程序,又无可用于校准的参考物质,或仅部分项目(AFP、CEA、HCG、PSA等)具有国际约定的参考物质。可靠溯源体系的缺乏,致使不同品牌的检测系统间不具备良好的可比性。

②干扰因素

    钩状效应。最常见的由方法学引起的干扰因素是钩状效应(hook effect),由于抗原抗体最适结合比例的限制,加入的抗原过量而造成结果的假性降低。尤其是在同时加入待测物和标记抗体的“一步法”中比较常见。随着方法学的改良和“两步法”的逐步取代,以及现代免疫学检测仪器所具备的抗原过量监测功能后,钩状效应日益减少,但有时会仍有发生。检验人员要实时关注患者的临床诊断,以及其他相关检测结果,对于结果与临床诊断明显不符的样本,可采用稀释后检测,或使用其他检测方法来复检。

    类风湿因子。类风湿因子在自身免疫病患者血清中很常见,其中以IgM型为最多。IgM和IgG型类风湿因子与检测试剂盒中二抗的Fc片段具有较强的结合能力,致使其易被误作为被测对象,而造成结果的假性增高。由于不同类型的类风湿因子的结合能力不同,因此对各检测系统的影响程度也有所差异,故对结果的影响程度不与含量成正比。解决的方法有:改良试剂盒,将捕获抗体用F(ab’)2替代完整的IgG;使用IgG固相吸附剂吸附样本中的类风湿因子;使用含有2-巯基乙醇的稀释液稀释样本,以降解IgM型类风湿因子。

    嗜异性抗体和人抗动物抗体。嗜异性抗体(HA)是由机体对非特异性、低纯度抗原的免疫应答所产生的具有足够滴度、能与多物种的免疫球蛋白发生结合的多重特异性免疫球蛋白。多为多特异性IgG抗体,结合能力较弱,可与多种动物的免疫球蛋白Fc和Fab表位结合,而不与抗原结合位点结合。人抗动物抗体(HAAA)是因使用动物源性疫苗或单克隆抗体进行免疫治疗,频繁与宠物的接触,刺激机体所产生的抗动物抗体。因现代单克隆抗体进行的免疫治疗多为鼠源性,所以人抗鼠抗体(HAMA)出现的频率最高。由于现代免疫检测体系中大量使用动物源性抗体,血清中的嗜异性抗体和抗动物抗体可与其结合而导致干扰。由于检测原理的设计所致,受其干扰的多为双抗体夹心法和竞争法。对于双抗体夹心法而言,若嗜异性抗体被误认为待测物,则会造成假阳性的结果;若与待测物竞争消耗标记抗体,则又会使结果降低甚至为阴性。这是由于其Fc段能与试剂抗体Fc段结合,其Fab段也能与试剂抗体Fab片段结合所致。利用阻滞剂与嗜异性抗体的非特异性结合而达到减少干扰的目的,可将样本中的嗜异性抗体吸附结合而减少或消除其影响;此外,改良检测步骤,例如增加洗涤次数,也可洗去结合能力较弱的嗜异性抗体。

③质量控制体系

    良好的检验质量控制体系是合格检验报告保证。美国临床生化科学院(NACB)临床实践要求规定:肿瘤标志物检测系统在正式开展运作前必须通过缜密的方法学验证,精密设计验证方案以符合其指南规范要求;对于质控物靶值的准确性应通过准确性、稳定性和线性方法学的评估,通过加入国际标准物质的回收率实验保证准确性;对于肿瘤标志物检测系统的重复性评价,要求批内不精密度<5%,批间不精密度<10%,室间质控数据应显示批内和批间较好的重复性;对于抗HA/HAMA干扰性,实验室应充分考虑到HA/HAMA干扰存在的可能性,并可采用上面所述的技术来降低干扰;对于溯源性,CEA, AFP, HCG, totalPSA, free PSA 溯源至国际参考标准,其他肿瘤标志物溯源至普遍认可的标准。美国病理学会(CAP)对于相关项目的室内质控要求如下:所有的检测项目都必须有室内质控,若市场上无供应质控品,则实验室应自己建立;定量检测项目至少要检测两个浓度水平的质控品;定性项目必须做阴、阳性质控,如有报告“弱阳性”结果,则必须加测“弱阳性”质控;必须按规定每天或每批次检测质控品。对于室间质评来说。每个项目均应参加国际、国内或地方的能力验证,若没有,则实验室应建立相应的准确度评估方法,并至少6个月评估一次。同时应及时评估能力验证结果,对于不合格的结果应寻找原因,并建立整改方案和纠正措施。

分析后因素

    在认真审核检验结果并发出报告后,临床医师和患者对该检验结果的解读与评价,是分析后最主要的部分。

    实验室应结合临床所提供的患者信息,协助临床医师分析检验结果,确保高质量的检验结果为接下来的临床诊治过程所服务。同其他检验指标所不同,评估肿瘤标志物检测结果应充分考虑生物变异和分析变异因素。少量增高或降低,未必具有临床意义,只有在升高或降低超过25%时才具有意义。对于患者个体来说,应与建立自身的基线参考值。尤其是对于肿瘤患者,个体化结果判断尤为重要,无论结果高于参考区间或为正常,持续升高是被认为有临床意义的表现,必须引起重视。另外,由于肿瘤标志物存在半衰期,结果解读时应充分考虑肿瘤标志物的半衰因素,并结合患者临床其他指标一并作为分析。

    方法学的变更。一般来说,实验室不应随意变更检测方法,但当确需变更时,应做好新旧检测方法的比对,以确认检测结果的可比性,同时建立新的参考区间,并将新方法及时告知临床,为患者重新建立基线或确定变化趋势做好准备。

    肿瘤标志物的检测对现代肿瘤的预防和诊治来说,是具有革命性意义的技术。总之,在筛选正常细胞和肿瘤细胞之间的个别蛋白的差异表达、确定与癌症发生的关键途径以及将癌症分成各种临床类型用于选择适用于特定治疗的患者等方面,基因谱和蛋白质组学具有振奋人心的潜能。随着更多的和全方位的诊断性、预测性、预后性肿瘤标志物检测进入肿瘤医学,将会使肿瘤患者从个性化诊疗中最大程度地获益。

 


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